等溫滴定量熱法

手套箱中的等溫滴定量熱儀

等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）在化學熱力學中，是一種物理技術，用於確定溶液中相互作用的熱力學參數，最常用於在無標記環境中研究小分子（如藥用化合物）與大分子（蛋白質、DNA等）的結合。由兩個封閉在絕熱夾套中的樣品池組成。要研究的化合物被放置在樣品池中，而另一個樣品池，即參比池，則用作對照，內含溶解樣品的緩衝液。

該技術由H. D. Johnston於1968年開發，是他在楊百翰大學完成的博士論文的一部分，在1988 年由MicroCal公司推出之前一直被認為是小眾技術。與其他熱量計相比，ITC的優勢在於不需要任何校正器，因為系統與環境之間沒有熱交換。

熱力學測量

等溫滴定量熱曲線

ITC是一種定量技術，可以確定結合親和力$K_{a}$、反應焓$\Delta H$和結合化學計量$n$，以及溶液中兩個或多個分子之間相互作用的結合比例。這是通過測量將一種分子的溶液注入含有另一種分子溶液的反應池所引起的一系列結合反應的焓值來實現的。將焓值與注射產生的摩爾比繪製成圖。從圖中可以看出摩爾反應焓$\Delta H$、親和常數$K_{a}$和化學計量學是通過曲線擬合確定的。反應的吉布斯自由能變$\Delta G$和熵變$\Delta S$的關係可以確定：

$\Delta G=-RT\ln {K_{a}}=\Delta H-T\Delta S$

其中，$R$是氣體常數，$T$是熱力學溫度。

要準確測量結合親和力，熱圖曲線必須是西格瑪曲線。曲線的輪廓由$c$決定，計算公式為：

$c=nK_{a}M$

其中$n$是結合的化學計量學、$K_{a}$是結合常數，而$M$是分子濃度。$c$值必須介於1和1000之間，理想情況下介於10和100之間。就結合親和力而言，c值在極限範圍內大約在10^3~7。

儀器測量

等溫滴定量熱儀示意圖

等溫滴定量熱儀由兩個相同的樣品池組成，樣品池由高效導熱和化學惰性材料（如哈氏合金或金）製成，周圍有絕熱夾套。靈敏的熱電堆/熱電偶電路用於檢測參比池（裝有緩衝液或水）和裝有大分子的樣品池之間的溫度差。在加入配體之前，先向參比池施加恆定功率（<1 mW），引導反饋電路，激活樣品池上的加熱器。在實驗過程中，配體以精確已知的等分量滴定到樣品池中，導致熱量吸收或散發（取決於反應的性質）。測量包括隨時間變化的輸入功率，以保持樣品池和參照池之間的溫度相等。

在放熱反應中，加入配體後樣品池的溫度會升高。這就導致樣品池的反饋功率降低（記住：參考池應用的是參考功率），以保持兩個池的溫度相等。在吸熱反應中，情況恰恰相反；反饋電路會增加功率以保持恆溫（等溫操作）。

觀察結果繪製成與時間相對應的將參照池和樣品池保持在相同溫度所需的功率圖。因此，實驗原始數據由一系列熱流（功率）尖峰組成，每個尖峰對應一次配體注入。對這些熱流尖峰/脈衝進行時間積分，得出每次注入的總熱交換量。然後可以分析這些熱效應作為[配體]/[大分子]摩爾比函數的模式，從而得出所研究的相互作用的熱力學參數。

為獲得最佳結果，每次進樣都應給予足夠的時間以達到反應平衡。為了獲得良好的測量結果，通常需要對樣品進行脫氣處理，因為樣品池中氣泡的存在會導致記錄結果中出現異常數據圖。整個實驗在計算機控制下進行。

最常見的直接滴定是通過將反應中的兩個成分直接結合在一起，用ITC來獲得熱力學數據。然而，許多化學反應和結合相互作用的結合親和力可能高於c窗口所需的親和力。為了解決c窗口和條件對某些結合相互作用的限制，可以採用各種不同的滴定方法。在某些情況下，根據結合機制的不同，只需在注射器和樣品池之間改變樣品進行反向滴定即可解決問題。對於大多數高親和力或低親和力的結合，需要進行螯合或競爭性滴定。這種方法是在樣品池中加入預先結合的複合物溶液，然後在所需的c窗口內用觀察到的較高結合親和力試劑將其中一種成分螯合。

分析與解釋

事後檢定和質子清單

收集到的實驗數據不僅反映了相關相互作用的結合熱力學，還反映了與之相關的任何競爭平衡。可以進行事後分析，通過簡單的赫士定律過程，從實驗熱力學中確定緩衝焓或與溶劑無關的焓。下例顯示了金屬離子（$M$）和配體（$L$）之間的簡單相互作用。$B$代表用於該相互作用的緩衝液，而${\ce {H+}}$代表質子。

$\Delta H_{ITC}=-\Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+(n_{H+})\Delta H_{BH}+\Delta H_{ML}$

因此，

$\Delta H_{ITC}=(n_{H+})\Delta H_{BH}+[-\Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+\Delta H_{ML}]$

進一步處理後可計算出金屬與配體相互作用的焓值。雖然這個例子是金屬和配體之間的相互作用，但它適用於任何有關結合相互作用的ITC實驗。

作為分析的一部分，計算與溶劑無關的熱力學需要一定數量的質子。繪圖即可輕鬆完成。

圖的線性方程是事後分析中上述方程的重新排列版，形式為 y = mx + b：

$\Delta H_{ITC}=(n_{H+})\Delta H_{BH}+[-\Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+\Delta H_{ML}]$

平衡常數

反應的平衡常數也與其他競爭平衡無關。競爭包括緩衝相互作用和其他pH依賴性反應，具體取決於實驗條件。在下式中，競爭因子$Q$包含了來自相關物質以外的其他物質的競爭：

$Q=\Sigma (\beta _{n}[\mathrm {X} ]_{n})$

其中， $X$表示緩衝液或質子等物質濃度， $\beta$表示它們的平衡常數，則

$K_{ML}=K_{ITC}Q$

應用

過去 30 年來，等溫滴定量熱法被廣泛應用於各個領域。過去，這項技術用於確定基本小分子相互作用的基本熱力學值。近年來，ITC被更多地應用於工業領域，如藥物發現和合成材料測試。雖然它在基礎化學中仍有大量應用，但趨勢已轉向生物方面，因為在生物方面，無標記和獨立於緩衝液的數值相對較難實現。

酶動力學

利用來自ITC的熱力學數據，可以推斷出酶動力學，包括質子或電子轉移、別構調節、協同作用以及酶抑制作用。ITC收集的數據會隨着時間的推移而變化，這對任何動力學實驗都非常有用，尤其是對蛋白質而言，因為它可以不斷進行等分注射。在計算方面，通過比較不同條件（pH 、使用突變肽鏈和結合位點等）下的實驗數據，可直接利用平衡常數和結合斜率來確定別構和電荷轉移。

膜和自組裝肽研究

膜蛋白和某些蛋白質的自組裝特性由於是一種無標記的熱量計，因此可以在這種技術下進行研究。膜蛋白很難選擇適當的溶解和純化方案。由於ITC是一種非破壞性的量熱工具，因此它可用作檢測器，通過將已知的結合配體與蛋白質結合，找到具有所需結合位點的蛋白質部分。這一特點也適用於自組裝蛋白質的研究，特別是用於測量其結構轉變的熱力學。

藥物開發

藥物需要在所需範圍內與蛋白質有效結合，因此結合親和力在藥物化學中具有重要意義。然而，在設計藥物時，確定焓變和優化熱力學參數非常困難。ITC通過推斷結合親和力、焓/熵貢獻及其結合化學計量學，解決了這一問題。

手性化學

有機金屬化合物的手性也可以通過這種技術推導出來。每種手性化合物都有其獨特的性質和結合機制，它們之間具有可比性，從而導致熱力學性質的差異。通過將手性溶液結合在一個結合位點上，可以推斷出手性的類型，並根據不同的目的，推斷出哪種手性化合物更適合結合。

金屬結合相互作用

MicroCal公司的Lin等人發表卵轉鐵蛋白與鐵的結合研究以來，將金屬離子與蛋白質和生物材料的其他成分結合是ITC最受歡迎的用途之一。這是由於生物系統中使用的一些金屬離子具有d¹⁰電子構型，無法用其他常用技術（如紫外-可見分光光度法或電子順磁共振）進行研究。由於生物系統中存在大量的金屬結合酶，這也與生化和藥物研究密切相關。

碳納米管及相關材料

在研究碳納米管以確定與生物分子的熱力學結合相互作用和石墨烯複合材料相互作用時，該技術得到了很好的應用。ITC與碳納米管的另一個顯著用途是優化石墨烯複合材料和聚乙烯醇製備碳納米管的過程。由於兩種成分的混合是一种放熱反應，因此 PVA 的組裝過程可以通過熱力學方法進行測量，其結合趨勢也可以很容易地通過ITC觀察到。

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