超高分辨率显微镜学

在光学显微镜学中，超高分辨率显微镜学是一结合多项技术的专有名词，此技术让影像分辨率能超越衍射极限。根据1873年恩斯特·阿贝的研究(特别是对于宽场光源)，光的衍射会造成传统光学显微镜分辨率的极限：一数值孔径N.A.，且入射光波长为λ的具衍射极限的显微镜的水平分辨率为d = λ/(2 N.A.)，垂直分辨率(z方向)也可以用同样的表达式给出。一个标准的光学显微镜分辨率在可见光范围约为水平200奈米、垂直600奈米。实验上，可达到的分辨率可量取点状物体的点扩散函数的半峰全宽求得。虽然显微镜的解析力并未完整定义，目前公认超高分辨率显微镜技术可达到比阿贝所定义的分辨率。

超高分辨率显影剂术包含单分子局域分析法、光子穿隧显微术、以及利用超级透镜、近场扫描式光学显微镜、4Pi显微镜、共聚焦显微镜(将针孔关闭)、或是经过反褶积 、侦测器相素重配等计算处理后的共轭焦显微镜影像，也包含利用结构性光源的显微镜技术(例如SIM以及垂直显像SMI)。

目前有两种主要的功能型超高分辨率显微镜学：

1. 决定性超高分辨率：常用在生物显微镜的发光物─萤光色素，受激后有非线性反应，此非线性反应可以用来提高分辨率，这些方法包括诱导发射抑制性显微术、激态抑制性显微术、可逆饱和光学萤光转换和SSIM。
2. 随机性超高分辨率：分子光源的化学复杂性提供时间域上的复杂表现，可以让许多非常接近的萤光色素在不同时间发光，因而可以在不同时间解析不同分子。这些方法包括超分辨率光变成像(SOFI)和全单分子局域方法(SMLM)如 垂直显像SMI、光活化局域性显微镜法, FPALM、STORM和dSTORM。

2014年10月8日， 诺贝尔化学奖颁发给艾力克·贝齐格, 威廉·莫尔纳尔和斯特凡·赫尔以表彰他们对"超高分辨率萤光显微镜"的贡献，这促使"光学显微镜进展到奈米尺度"。

历史

在1978年，已有第一个突破阿贝极限的理论，其试图透过4Pi 显微镜来当作共轭焦激光扫描萤光显微镜。其原理利用两个相反的物镜的透光，同时打在样品的异侧，以增加立体角。

超解析技术

近场光随机测绘(NORM)显微镜

近场光随机测绘(NORM)显微镜是一种透过观察在浸液中的奈米粒子的布朗运动，并透过远场显微镜光学采集奈米粒子的近场资讯。

NORM利用随机移动的奈米粒子来扫描物体表面。透过这个显微镜，奈米粒子看起来像对称的圆点。圆点的宽度等于点扩散函数，并决定显微镜的分辨率。特定粒子的水平座标分辨率比同等光学显微镜的分辨率还要高。透过收集多张影像，我们可以划出整个视野范围的近场的强度分布图。 与NSOM和ANSOM比较，这种方法不需要任何特殊的尖端定位设备，并可以达到大视野和深焦长。 由于"感测器"可以大量扫描，图像获取时间可以缩点。

4Pi显微镜

一 4Pi显微镜是一个激光扫描的荧光显微镜，其改进了轴向分辨率。从传统的500至700 纳米可以提高到100-150 纳米，比标准的 焦显微镜几乎减少5至7倍的球焦点体积，.

透过同时将两个反向的物镜聚焦在同一个位置上可以提轴向的分辨率。且调整通过物镜的两道光的光程差，使其最小。透过这个方法，在两物镜共同聚焦处的分子可以被相干地照亮，且可以收到相干地反射光或是穿透光，例如：侦测器可以接收到发射光地相干叠加。用于照明与侦测的体角 $\Omega$也增加并接近理想状态(样品同时照射和检测到来自各方向的光)。

在图中显示4Pi显微镜的操作模式。 激光由一分光镜 (BS)分光并透过镜子打在两个相反的物镜。在共同焦点处，两道聚焦光束会叠加。 激发的分子在这个位置发出荧光，且被两个物镜收集，由同一分光镜收集，最后被分色镜 (DM)偏折至接收器。

在理想情况下，每个物镜可以收集立体角 $\Omega =2\pi$的光线。 因此，有两个物镜可以收集所有方向方向的光(立体角 $\Omega =4\pi$)。 名此显微镜也是得名于其最大可激发和侦测光的角度。实际上，物镜最多只可达到约140°的孔径角，其对应 $\Omega \approx 1.3\pi$。

结构式照明显微镜(SIM)

• Images of cell nuclei and mitotic stages recorded with 3D-SIM.
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  比共焦镜 –3D-SIM
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  细胞核中的 前期 从各种角度
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  两个老鼠的细胞核的在前期的。
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  老鼠的细胞在 末期