革蘭氏染色
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革蘭氏染色(英語:Gram stain)是用來鑑別細菌的一種方法:這種染色法利用細菌細胞壁上的生物化學性質不同,可將細菌分成兩類,即革蘭氏陽性(英語:Gram Positive)與革蘭氏陰性(英語:Gram Negative)。這一染色方法由丹麥醫生漢斯·克里斯蒂安·革蘭於1884年所發明,最初是用來鑑別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關係[1],後推廣為鑑別細菌種類的重要特性之一,對由細菌感染引起的疾病的臨床診斷及治療有著廣泛用途。
革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對抗生素的反應並不一樣,因而通過抽取樣品醫生可以在很短的時間內(5分鐘左右)確定細菌的革蘭氏性質,醫生從而可依據結果初步判斷,迅速給病人注射抗生素,而不需要等待幾天細菌培植得到的化驗結果。然而並非所有的細菌都可以通過革蘭氏染色歸類,如分歧桿菌等則需進行抗酸染色鑑別[2]。
染色結果
[編輯]革蘭氏染色的對象是細菌的細胞壁。染色後的細菌可在顯微鏡下更好的觀察,以便於區分。不同的細菌在該染色法的作用底下反應不同,藉以主要區分成為以下的類型:
革蘭氏陽性菌
[編輯]革蘭氏陽性菌,胞壁染色後呈藍紫色。
革蘭氏陰性菌
[編輯]革蘭氏陰性菌,染色後呈紅色。
不確定或者多變
[編輯]一些細菌經過革蘭氏染色之後顯示出多種顏色,如同時出現紫色和粉色的細胞[3]。
另一些的染色結果則是隨機的,無法被歸類於革蘭氏陽性或陰性。
除此之外,對於所有細菌來說,培養的時間都可能影響染色結果[3]。
染色流程及原理
[編輯]流程可概括為:染色-脫色-複染。
- 第一步:初染劑(Primary Stain)
使用結晶紫[註 1]染色,染色部位主要為染細胞壁上的肽聚醣。
- 第二步:媒染劑(Mordant)
加入複方碘溶液或稱革蘭氏碘液(Gram's Iodine)後,兩者會形成不溶性的結晶紫-碘(CV-I)複合體。細菌呈紫黑色。第二步是關鍵,它的目的是分辨細菌的革蘭氏染色特性。若為革蘭氏陽性菌,此複合體係結合於細胞壁之鎂、核糖核酸(Magnesium Ribonucletic Acid),形成鎂-核糖核酸-結晶紫-碘(Mg-RNA-CV-I)複合體,不易脫去,染劑也就固定下來了。
- 第三步:脫色劑(Decoloring Agent)
使用酒精(95%)脫色,試劑具脂溶劑(Lipid Solvent)和蛋白脫水劑(Protein Dehydrating Agent)之雙重功能。此步驟對革蘭氏陽性細菌無效,因為其細胞壁上厚厚的細胞壁(成分為肽聚醣)層次多,交聯緻密,故遇脫水時網孔縮小,再加上不含類脂,使得乙醇不會溶出縫隙,因此阻隔了結晶紫-碘複合體的外滲,仍然呈紫色只能留在細菌體內。革蘭氏陰性菌細胞壁層薄,外膜類脂含量高、肽聚醣層薄和交聯度差,在遇脫色劑時,以類脂爲主的外膜迅速溶解,薄而鬆散的肽聚醣網不能阻擋複合體溶出,因此會被脫色而成為無色。
- 第四步:複染劑(Counterstain)
為了對比,在此之後會加入番紅(Safranin)進行複染,革蘭氏陰性菌成紅色,而革蘭氏陽性菌仍保有原來的紫色。[4]
定性
[編輯]KOH-試驗
[編輯]另外的一種方法是氫氧化鉀-試驗。將培養好的細菌取出一小部分,使其懸浮於一滴KOH溶液中。革蘭氏陽性菌與之不發生反應,用細針穿過該溶液,溶液呈正常液體狀。革蘭氏陰性菌因細胞壁中主要成分為脂多醣,脂質含量較高,接觸強鹼KOH後與KOH發生皂化反應,以細針穿過會有明顯黏稠狀。
胺肽酶試驗
[編輯]除了個別例外,只有革蘭氏陰性菌才能證明胺肽酶的存在。這是該試驗的基礎。 將要進行試驗的細菌放入試管加水。放入一張顯示肽酶活性的試紙,在37°C下等待10到35分鐘,試紙變成深黃色。
參見
[編輯]外部連結
[編輯]- 丁香園上的「革蘭氏染色法(原理、方法和意義) (頁面存檔備份,存於網際網路檔案館)」(簡體中文)
- 實驗二十二 簡單染色法和革蘭氏染色法 (頁面存檔備份,存於網際網路檔案館)(簡體中文)
- 微生物學實驗 (頁面存檔備份,存於網際網路檔案館)之「實驗二、革蘭氏染色法」(繁體中文)
- 高瞻生物實驗手冊 (頁面存檔備份,存於網際網路檔案館)之「實作二:細菌染色觀察(簡單染色法、革蘭氏染色法)」(繁體中文)
- Gram staining technique video (頁面存檔備份,存於網際網路檔案館)(英文)
參考文獻
[編輯]注釋
[編輯]引用
[編輯]- ^ Colco, R. Gram Staining. Current Protocols in Microbiology. 2005, 00 (1): Appendix 3C. ISBN 978-0471729259. PMID 18770544. doi:10.1002/9780471729259.mca03cs00.
- ^ THE ACID FAST STAIN. Georgia Highlands College. [2017-06-09]. (原始內容存檔於2017-06-10).
- ^ 3.0 3.1 Beveridge, Terry J. Mechanism of Gram Variability in Select Bacteria. Journal of Bacteriology. March 1990, 172 (3): 1609–1620. PMC 208639 . PMID 1689718. doi:10.1128/jb.172.3.1609-1620.1990.
- ^ 微生物学(第8版十二五普通高等教育本科国家级规划教材): 第三章. 2016. ISBN 9787040444957.